使用动物程序进行曲美替尼治疗

　　曲美替尼是丝裂原激活细胞外信号调控激酶1(MEK1)和MEK2激酶活性的可逆性抑制剂。

　　MEK蛋白是细胞外信号相关激酶(ERK)途径的上游调节因子，能促进细胞增殖。

　　曲美替尼可通过抑制MEK抑制BRAFV600突变阳性癌细胞的生长。

　　使用6-8周龄时体重在20到25克之间的雄性C57BL / 6J小鼠(Charles River UK Ltd.)。根据公开的方法建立了UUO。简言之，将小鼠用异氟烷麻醉并腹腔使用中线剖腹手术露出。随后，使用无菌的5–0丝编织缝合线(Pearsalls)分离右输尿管，并与骨盆相距0.5 cm。

　　左输尿管松开，用作假手术对照。使用5-0脯氨酸缝合线(Ethicon)闭合所有切口。翌日和用于在总共6天，trametinib(3毫克/公斤)通过口服强饲法每日一次给药(100 μl每只动物)。安乐死前2小时给予曲美替尼最终剂量。

　　根据已公开的方法，首先将曲美替尼溶解在DMSO中，并稀释成含终浓度为0.5%羟丙甲纤维素(Sigma)和2%Tween-80(Sigma)的水合剂。对照动物接受了载具。DMSO的最终浓度为0.2%v / v，以盲方方式施用曲美替尼或媒介物。

　　在一项平行研究中，UUO后4天每天一次给予曲美替尼(3 mg / kg)或赋形剂，持续6天。在第10天，收获肾脏。将每只动物(UUO和假手术)的两个肾脏纵向切成两半。

　　每个肾脏的一半在液氮中速冻，然后保存在-80°C进行蛋白质印迹。另一半在4°C下用10%福尔马林(Sigma)固定16小时，然后再转移到70%v / v乙醇溶液中24小时，然后包埋在石蜡中进行免疫组化。

　　在第二组实验中，给小鼠喂食含有0.15%w / w腺嘌呤的啮齿动物饮食(824534 RM1)(SDS饮食; LBS-Biotech，Hookwood，英国)，为期2个月。

　　过量的腺嘌呤经过酶修饰，最终在肾小管中沉淀，导致进行性肾小管损伤最终导致坏死，并伴有巨噬细胞浸润，肾纤维化和肾功能减退。

　　我们使用了0.15%w / w的含腺嘌呤饮食，因为发现随时间推移(长达4个月)会导致进行性肾衰竭，而在高腺嘌呤饮食中未观察到体重过多减轻(J. Kieswich，个人交流) 。

　　每天两次通过口服管饲法向动物给予曲美替尼(0.3 mg / kg)或赋形剂，持续2个月，并如针对UUO模型所述收获肾脏。